院所科研动态
γ-氨基丁酸（GABA）是自然界广泛存在的一种四碳非蛋白质氨基酸，广泛分布在动植物和微生物中，具有降血压、强化肝肾功能、调节激素分泌、延缓衰老、改善人体亚健康状态等功效，在医疗、化妆品、饲料等行业均有广泛应用。
GABA的生产方法主要有化学合成法、植物富集法、微生物发酵法、全细胞（或酶）转化法。化学法合成法的产量相对较高，但生产过程能耗高、安全性差、成本高且污染环境，生产的GABA为非“食品级”产品，不能应用于食品行业。植物富集法条件比较温和，但生成的GABA产量很低，因此不适合提取纯化，富含 GABA 的植物常作为功能性原料，如中国水稻研究所开发的“基尔米”。微生物发酵法生产GABA产量较高，但存在发酵周期较长，培养基体系复杂，分离纯化困难等缺点。全细胞（或酶）法转化法具有产量高、反应条件温和、周期短、分离提纯方便等优点。尤其是全细胞转化法生产GABA可避免复杂的酶纯化过程，不但降低了成本，而且提高了转化稳定性，且可循环多次转化，优势更明显。
目前，微生物发酵和全细胞转化所用的微生物主要有大肠杆菌、谷氨酸棒杆菌和乳酸菌。大肠杆菌本身谷氨酸脱羧酶（GAD）活性很低，因此用于生产的大肠杆菌均为强化了GAD活性的基因工程菌，加之其本身会产生内毒素，生产的GABA存在一定的安全隐患，因此大肠杆菌工程菌株生产的GABA常用于化工原料。大肠杆菌生产GABA通常采用转化法。但转化法的前提是获得菌体，而大肠杆菌发酵生产菌体的培养基常用添加了抗生素的LB培养基，培养到一定阶段后还要添加诱导剂使GAD酶在菌体中大量表达，诱导结束后才能收集菌体。因此其发酵产菌体的过程培养基成本高，且含有杂质多，且无GABA产生，因此发酵液完全没有利用价值。大肠杆菌的转化生产水平比较高，最新的报道大肠杆菌的单次转化生产GABA水平可达308.26 g/L （Appl Microbiol Biotechnol. 2018;102(8):3623–3633. ），循环转化10次总产量可达2.771 kg/L（J Biol Eng. 2019;13:24 ）。谷氨酸棒杆菌缺乏GAD系统，因此采用谷氨酸棒杆菌发酵生产GABA必然要采用基因工程方法整合外源GAD系统来改造菌种，这种基因工程菌的优势在于由葡萄糖发酵生产GABA时不用添加底物谷氨酸或谷氨酸盐。然而该基因工程菌往往需要2阶段控制pH发酵，生产周期长，产量低。目前最高的生产水平是补料分批发酵92h, 产112.03 g/L的GABA（Syst Microbiol and Biomanuf (2024). https://doi.org/10.1007/s43393-024-00236-0）。当然采用基因工程菌生产的GABA有潜在的风险，不能用作“食品级”的产品。即使采用食品公认的安全菌株谷氨酸棒杆菌改造的生产菌株生产的GABA产品依然不被日韩认可，也不被我国新食品原料认可。乳酸菌是公认的食品级安全菌株，但国家卫生和计划生育委员会颁布的新食品原料目录中，规定只有短乳杆菌（Lactobacillus brevis）和希氏乳杆菌（Lactobacillus hilgardii）生产的GABA才能作为新食品原料，其它乳酸菌发酵生产GABA只适合开发乳酸菌发酵产品，例如含GABA的酸奶，不能分离提取GABA并作为新食品原料。
天津科技大学生物工程学院生化过程与技术研究团队前期筛选到一株产GABA的短乳杆菌，该菌株未经任何基因工程改造，仅采用复合诱变选育和工艺优化等方法提升短乳杆菌产生GABA的能力，获得了具有竞争力的“食品级”GABA生产水平。以前针对短乳杆菌生产GABA的研究常将微生物发酵生产过程或全细胞转化生产过程单独进行优化，而事实上发酵过程除了产生富含GABA的发酵液，还会产生大量的菌体细胞，将菌体细胞收集后可用于全细胞转化生产GABA。因此，将短乳杆菌发酵与全细胞转化过程综合考虑，进行全局优化高效生产GABA，对于促进食品和医药级GABA的工业化规模生产具有十分重大的意义。
2. 项目内容
本项目关键内容包含生产菌株、发酵工艺、转化工艺、纯化工艺。
2.1 生产菌株
短乳杆菌（L. brevis）CGMCC NO.3404菌株，可提供专利菌株保存证书。菌株特色：①该菌株是新食品原料认可菌株，产品可以标新食品原料标志，这是很好的卖点；②该菌株未经过基因改造，绝对安全，且如果将来想进行基因改造会更容易，因为如果一株菌已经进行了各种基因改造，那么再想改造通常具有抗性，而改造野生菌会容易的多；③该菌株自筛选出来的10余年间，经历了传统理化诱变、现代等离子注入诱变、N+离子注入诱变等多种方法的育种，已经更新了很多代，至少7-8名研究生的辛苦付出才有了现在的高产菌株；④该菌株现在各方面水平甚至超越基因工程的大肠杆菌，达到国际领先的水平。
2.2 发酵工艺
采用上述短乳杆菌 (L. brevis) CGMCC NO. 3414菌株，在优化的种子培养基和优化的条件下制备发酵液种子，在5~10 L发酵罐中完成发酵实验。在优化的发酵培养基和发酵条件下发酵生产GABA。发酵生产指标：周期≦48 h，发酵GABA产量≧180 g/L，转化率≧98%。发酵工艺具有操作简单、易控、产量高、周期短、转化率高、染菌风险小等特点。
2.3 转化工艺
当发酵进行至终点时，放罐离心收集菌体，获取湿菌体。配制转化体系，添加适量的湿菌体，在优化的转化条件下转化生产GABA。转化生产指标：转化周期≦8 h，转化GABA产量≧300 g/L，转化率≧99%。全细胞转化工艺具有产量高、周期短、转化率高、体系简单、纯化方便等诸多优点。
2.3 纯化工艺
可按企业需求订制不同纯度GABA，如≧60%、≧90%、≧99%等。纯度越高收率越低，通常直接喷干的发酵液产品，GABA纯度在65%左右，产品收率大于90 %；直接喷干的转化液产品，GABA纯度在85%左右，产品收率大于90 %；精制的转化液产品，GABA纯度在99%左右，产品收率大于82 %。
3. 项目水平
1) 本项目所采用的菌株符合新食品原料规定，经过5升发酵罐多次验证，无论发酵、转化的GABA产量和转化率均达到国际先进水平。2011年 8月，经天津市科委组织专家鉴定，由天津科技大学生物工程学院高强教授主持的天津市科委自选项目《高产 γ-氨基丁酸菌株选育及发酵生产工艺的研究》达到国际先进水平（津科成鉴字 2011[293号]）。
4. 成本核算
由此可见，本工艺技术先进，符合国家新食品原料法规，产品可出口日韩而不受限制。产品市场售价为本团队初步调研结果，但总体差不多。如果低纯度产品和高纯度产品市场售价如此悬殊，我们也可以从发酵液纯化99%纯度的GABA产品。虽然收率低一些，但是利润率更高。另外，本工艺循环转化次数越多利润率越高。无论发酵清液还是菌体都是有价值的产品，全程无浪费，纯化工艺绿色环保。
5. 获得成果
1）高年发，张颖，高强，宋磊，冯宇，张健，王德培. 一种高产γ─氨基丁酸的生产方法及应用。国家发明专利授权号：ZL201110051732.X，授权公告日：2012年8月22日。
2) 高强，高年发，石秀峰，常传友，朱燕. 一种利用生物转化法制备γ-氨基丁酸的方法。国家发明专利授权号：ZL201510626277.X，授权公告日：2018年2月23日。
3) 张健，才恒，高强，申振豪. 一种提高短乳杆菌全细胞转化生产γ-氨基丁酸的方法， 申请日：2022年4月18日，国家发明专利申请号：CN202210402135.5
4) 张健,高强,申振豪,吐鲁洪·托乎提,张颖.一种采用短乳杆菌生产食品级 γ-氨基丁酸的方法，2023 年 05 月 16 日, 国家发明专利申请号：CN2023105489920
5) Wenyan Ma, Jian Zhang, Liang Shu, Xinqi Tan , Ya An , Xinda Yang, Depei Wang, Qiang Gao.Optimization of spray drying conditions for the green manufacture of γ-aminobutyric acid-rich powder from Lactobacillus brevis fermentation broth. Biochemical Engineering Journal 156 (2020) 107499
6) Chuanyou Chang, Jun Zhang, Shenxi Ma, Lin Wang, Depei Wang, Jian Zhang, Qiang Gao. Purifcation and characterization of glutamate decarboxylase from Enterococcus raffnosus TCCC11660. Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology, 2017, 44(6):817-824.
7) Shi Xiufeng, Chang Chuanyou, Ma Shenxi, Cheng Yibin, Zhang Jian, Gao Qiang. Efficient bioconversion of L-glutamate to γ-aminobutyric acid by Lactobacillus brevis resting cells[J]. Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology, 2017, 44(4-5):697-704.
8) Qiang Gao, Qiang Duan, Depei Wang, Yunze Zhang, Chunyang Zheng. Separation and purification of γ-aminobutyric acid from fermentation broth by flocculation and chromatographic methodologies[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2013, 61:1914-1919.
9) 张健，才恒，申振豪，刘仲浩，赵娟，张巧珍，高强。烟酸促进短乳杆菌合成 γ-氨基丁酸的机制，生物技术通报，2022, 38(10):235-242
10) 石秀峰，纪曾春，常传友，马身喜，张变强，高强。利用多功能等离子体诱变系统快速诱变选育γ-氨基丁酸高产菌株，2016， 35 （4）127-130
11) 段强，高强，张朝正，张云泽，司晓光，郑秀，高年发，从棉子糖肠球菌发酵液中提取γ-氨基丁酸的初步研究，2012,37（12）217-222
12) 陈慧敏，高强，苏喆，王梦晓，段强，张云泽，司晓光。高产 γ-氨基丁酸的棉子糖肠球菌的筛选、鉴定及其摇瓶发酵条件的优化，2012, 39(11): 1642-1652
13) 张颖，高年发，段强，于韶梅。破壁方法对短乳杆菌谷氨酸脱羧酶提取效果的影响，安徽农业科学， 2011，39( 34) : 20969 － 20970，20981
14) 张颖，高年发，宋磊，段强，于韶梅。N+ 离子诱变选育高产γ-氨基丁酸突变株，中国酿造，2011 ， 8 ：117-121
15) 冯宇，高年发，张颖，潘超强，宋磊。短乳杆菌生产γ-氨基丁酸培养基的优化。2010, 26（1）：34-37
6. 市场前景
近年来，随着人们对健康的重视和追求，含GABA的功能食品也有越来越多的报道， 2023年，全球GABA市场销售额达到8.6亿；到2029年，市场规模有望达到13.7亿，年复合增长率（CAGR）为8.08%（2023-2029)。
中国是全球GABA的主要生产地区，其产量占全球总产量的绝大部分。中国市场也是全球最大的消费市场之一。2022年占有62.05%的市场份额，GABA消费市场规模达到了4.9亿，约占全球市场的61.37%。预计未来几年，中国市场的消费规模将继续扩大，占全球市场的比例也将进一步提升。
目前国内有10多家企业生产GABA，但真正的食品级的产品很少。很多企业打擦边球，所用生产菌株非新食品原料允许的生产菌株，这类产品可出口欧洲（价格较低，5万元/吨），但无法出口日韩，也无法在国内作为新食品原料售卖，但我们的产品敢于贴新食品原料标签，这是很好的卖点，竞争力强。目前食品级99%纯度的新食品原料GABA产品市场价50～60万元/吨，利润率高。
7. 项目联系人
天津科技大学生物工程学院生化过程与技术研究团队
张健老师，手机号：13920403716，电子邮箱：zj96sk@tust.edu.cn
